Un microscope confocal, aussi appelé microscope monofocal, est un microscope optique qui permet de réaliser des images d’une profondeur de champ d’environ 400 nm qui sont appelées sections optiques. 

Le microscope confocal représente une avancée significative dans le domaine de la microscopie, offrant une capacité unique de visualisation en trois dimensions. En ajustant le plan focal de l’objectif à différents niveaux de profondeur dans un échantillon, il est possible de créer des séries d’images. Ces images sont ensuite assemblées par un ordinateur pour produire une représentation tridimensionnelle précise de l’objet étudié, permettant une observation détaillée qui va au-delà de la vision directe.

Ce type de microscope utilise soit de la lumière réfléchie soit de la fluorescence pour éclairer les échantillons, avec un laser servant le plus souvent de source lumineuse. Cela caractérise le microscope confocal à balayage laser (MCBL), connu internationalement sous l’acronyme CLSM (Confocal Laser Scanning Microscope).

Le concept du microscope confocal a été initialement proposé par Marvin Minsky en 1953. Toutefois, ce n’est qu’à la fin des années 1980 que des modèles commerciaux sont devenus disponibles, rendant cette technologie accessible à un large éventail de laboratoires. Aujourd’hui, la microscopie confocale est largement utilisée, tant en biologie qu’en sciences des matériaux, en raison de sa capacité à fournir des images détaillées et profondes des échantillons.

Limite du microscope optique par rapport au microscope confocal

En microscopie optique à champ large, la netteté de l’image dépend de la position de l’objet dans le plan focal du système optique. Quand un objet est épais, présente un relief marqué, ou est incliné par rapport à l’objectif, seule une fraction de cet objet apparaît nette sur l’image, un phénomène expliqué par la profondeur de champ limitée.

Cette limitation de la profondeur de champ devient d’autant plus problématique avec l’augmentation du grossissement. À fort grossissement, il devient difficile d’obtenir une image entièrement nette d’un objet étendu. Cette contrainte est particulièrement gênante pour l’observation d’objets allongés tels que les nerfs, qui apparaîtront flous sur une partie de leur longueur, indépendamment de la qualité de la préparation. Les surfaces rugueuses ou irrégulières, comme les faciès de rupture, posent également problème.

La microscopie à champ large est ainsi limitée pour l’étude d’objets dont le volume à observer n’est pas une fine tranche perpendiculaire à l’axe optique. Ce problème se manifeste dans deux situations principales :

• En réflexion : Pour les surfaces qui ne sont ni planes ni perpendiculaires à l’axe optique, la clarté de l’image est compromise.
  
• En fluorescence : Pour les objets épais, la lumière nette émise par le plan focal est noyée dans la fluorescence émise par les plans adjacents, qui sont, par définition, flous.

Dans ces cas, la microscopie à champ large révèle ses limites, car elle ne peut pas fournir une image claire et nette sur l’ensemble du volume d’un objet complexe ou étendu.

Fonctionnement du microscope confocal

Le microscope confocal offre une solution ingénieuse au problème de netteté des images en microscopie. Au lieu d’utiliser un faisceau de lumière blanche émis par une lampe traditionnelle, le microscope confocal emploie un faisceau laser. Ce laser, focalisé par une lentille (qui, dans le design original de Marvin Minsky de 1957, est identique à l’objectif optique), balaie la surface de l’échantillon. Un élément clé de ce système est le sténopé (ou “pinhole” en anglais) positionné devant le détecteur, dans un plan focal conjugué à celui de l’objectif. Ce dispositif permet de ne laisser passer que les photons issus du plan focal à travers le sténopé, contribuant ainsi à la formation de l’image. C’est cette caractéristique qui a donné son nom au microscope : “confocal”, signifiant essentiellement “monofocal”.

Cette technique bloque la lumière provenant des plans non focaux (et donc flous) grâce aux bords du sténopé. Il en résulte une coupe optique claire et nette correspondant précisément au plan focal. En ajustant le plan focal, une série de coupes successives peut être obtenue, fournissant ainsi des informations détaillées et précises dans les trois dimensions de l’objet observé.

Le microscope confocal est utilisé non seulement pour l’analyse de matériaux fixés, mais aussi pour l’étude de phénomènes dynamiques dans des cellules ou tissus vivants. Cette capacité est grandement renforcée par l’utilisation de molécules fluorescentes comme la GFP (Green Fluorescent Protein). De plus, les avancées continues dans la technologie confocale ont ouvert des voies pour explorer des processus d’interaction moléculaire, tels que ceux étudiés en FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), et de dynamique moléculaire, comme en FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) et FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching)

Composants clés d’un microscope confocal

Un microscope confocal typique intègre une série de composants essentiels pour sa performance exceptionnelle. Ces éléments sont illustrés dans l’image ci-dessous et comprennent :

Source d’Excitation Laser : Ce composant émet un faisceau laser concentré sur l’échantillon. La source laser est cruciale pour fournir l’éclairage nécessaire pour l’illumination et la capture d’images précises.

Filtres Dichroïques à Fluorescence : Ils jouent un rôle double. D’une part, ils réfléchissent la lumière d’excitation vers l’échantillon. D’autre part, ils transmettent la lumière fluorescente émise par l’échantillon au système de détection. Ce processus permet de distinguer clairement l’éclairage d’excitation de la réponse fluorescente de l’échantillon.

Sténopé : Un élément vital des microscopes confocaux, le sténopé agit comme un filtre spatial. Il bloque la lumière qui n’est pas alignée (confocale) avec le plan focal de l’objectif, empêchant ainsi toute interférence indésirable avec l’image.

Moteurs Pas à Pas : Ces moteurs déplacent le faisceau laser de manière incrémentielle sur l’échantillon, permettant des balayages précis le long des axes x et y et sur l’axe z. Grâce à cette technologie, la collecte de données tridimensionnelles est automatisée, facilitant la création d’images 3D détaillées.

Objectif : Pour atteindre une haute résolution, un objectif à haute ouverture numérique (NA) est typiquement utilisé. Des objectifs à immersion, soit dans l’eau soit dans l’huile, sont fréquemment employés pour corriger le décalage de l’indice de réfraction, en particulier dans les milieux aqueux où sont conservés de nombreux échantillons vivants. De plus, des distances de travail étendues sont nécessaires pour l’imagerie d’échantillons épais et pour le sectionnement optique 3D.

Autres techniques de microscopie confocale

Microscope confocal à disque rotatif (Disque de Nipkov)

Ce type de microscope utilise un Disque de Nipkov et est principalement employé avec de la lumière blanche. Son atout majeur réside dans la capacité de scruter simultanément plusieurs points, ce qui est avantageux compte tenu du temps nécessaire pour observer chaque point individuellement. L’utilisation de la lumière blanche permet d’obtenir des images en couleur, enrichissant ainsi la qualité visuelle des observations.

Microscope confocal spectral (Chromatique)

Le système CHROMATIC de microscopie confocale chromatique s’appuie sur le principe de la microscopie confocale traditionnelle, mais utilise une optique délibérément chromatique. Conceptuellement, cet appareil peut être envisagé comme une superposition de microscopes confocaux classiques, chacun dédié à une longueur d’onde ou couleur spécifique. Une analyse spectrale de la lumière traversant le diaphragme (ou filtre spatial) permet de déterminer la position de l’objet dans la plage de mesure du capteur.

Cette méthode est utilisée pour mesurer la rugosité d’un échantillon, réaliser des acquisitions de profils et de topographies, et, dans le cas de matériaux transparents, mesurer leur épaisseur avec une précision de quelques microns. Elle trouve son application principalement dans la mesure d’épaisseur de verre, en micro-électronique pour la mesure d’épaisseur de wafer ou la mesure de hauteur des protubérances (bumps).

Résolution

La microscopie confocale chromatique offre une résolution axiale de quelques nanomètres et une résolution latérale inférieure au micron. Les plages de mesure accessibles s’étendent de quelques dizaines de microns à plusieurs dizaines de millimètres.

L’acceptance angulaire de ces microscopes est comparable à celle des microscopes classiques, pouvant atteindre jusqu’à 45° sur des matériaux réfléchissants et 85° sur des matériaux diffusants, sans effet d’ombre.

La flexibilité de la microscopie confocale chromatique permet son adaptation à divers types de mesures exigeant une haute résolution sur des étendues de quelques dizaines de millimètres.

Périmètre

La microscopie confocale peut être utilisée en complément d’autres techniques de mesure, telles que l’interférométrie en lumière blanche ou l’interférométrie à faible cohérence. Ses principaux avantages sont la flexibilité de configuration de mesure, la précision et la rapidité, la rendant idéale pour des mesures de profils de grande dimension ou de topographie.

Elle est moins adaptée que l’interférométrie en lumière blanche pour les champs d’observation de quelques centaines de microns nécessitant une acquisition d’image très rapide. De même, pour des étendues de mesure supérieures à 40 millimètres, l’interférométrie à faible cohérence, capable de mesurer jusqu’à 600 mm (voire plusieurs mètres) avec une précision de 100 nm, peut être préférée.